NGS concentração da biblioteca (ng/µL → nM) | diluição e pooling

Como usar (3 passos)

Escolha um exemplo ou insira a concentração da biblioteca (ng/μL ou nM) e o comprimento do fragmento (bp).
Selecione um alvo nM e volume final para ver uma receita de diluição (estoque + água).
Escolha um método de agrupamento e revise os volumes por biblioteca e nM agrupados (guia).

A conversão para nM depende do comprimento, dos fatores de PM e do método de quantificação. Trate os resultados como um guia e siga seu protocolo para decisões finais.

Entradas (tabela da biblioteca)

Exemplo (predefinido)

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Colar (CSV/TSV)

Cole diretamente do Excel/Planilhas (separado por tabulação ou vírgula). Colunas de exemplo: nome, ng_per_uL, comprimento_bp, nM (os nomes das colunas podem variar).

Nome	Modo de entrada	ng/µL	Comprimento (bp/nt)	nm (entrada)	Concentração (nM)	Ações

A tabela rola horizontalmente (deslizar ou arrastar).

Tipo de molécula (dsDNA, etc.)

Tipo de molécula Fator PM (g/mol/pb ou nt)

dsDNA (660 g/mol/bp) é um guia comum para NGS. Os valores podem variar de acordo com o método e a definição.

Normalização (diluir para corresponder a nM)

Predefinição nM alvo Concentração alvo (nM)

Predefinição de volume final Volume final (µL)

Agrupamento

Método

Volume por biblioteca (µL)

Resultados (conversão, diluição, agrupamento)

Nome	Estoque (nM)	Diluição: estoque (µL)	Diluição: água (µL)	Volume da piscina (µL)

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Como é calculado

Conversão (guia): nM = (ng/µL) × 1e6 / (comprimento × MW_per_bp)
Diluição: C1V1 = C2V2 (V_estoque = (C_alvo/C_estoque) × V_final)
Agrupamento direto de molares iguais: aloque volumes de forma que C_i × V_i seja igual (dado o volume total)

A conversão depende do comprimento, dos fatores de PM e do método de quantificação. Use esses resultados como um guia.

FAQ

Para que é usada a conversão ng/µL → nM?

Use-o para normalizar bibliotecas por contagens de moléculas para agrupamento molar igual (diferente de massa igual).

Onde obtenho o comprimento do fragmento (bp)?

Use o tamanho médio de um relatório do Bioanalyzer/TapeStation. Mantenha a inclusão do adaptador consistente com a definição do relatório.

Qual é a diferença entre agrupamento de massa igual e agrupamento de molar igual?

Massa igual corresponde a valores ng, enquanto molar igual corresponde a contagens de moléculas (nM). Se os comprimentos diferirem, massas iguais não equalizarão as contagens de moléculas.

O que é normalização?

Normalize diluindo todas as bibliotecas para o mesmo nM e, em seguida, agrupe volumes iguais. Esta ferramenta fornece esse fluxo recomendado.

O volume de diluição é muito pequeno (por exemplo, 0,2 μL).

Volumes muito pequenos são difíceis de pipetar. Considere diluição intermediária ou ajuste do volume final.

Posso usar valores nM (ou pM) de qPCR?

Sim. Use o modo de entrada nM direto. Observe que as definições de quantificação podem diferir de acordo com o método.

A concentração combinada será exata?

É um guia. Erros de quantificação e pipetagem e variação no comprimento do fragmento podem alterar o valor final.

Comentários

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